2005

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An extensive structural–functional comparison of bothropic Lys49-PLA2s, which includes the MjTX-II and MjTXII/ stearic acid complex structures, has been recently done. This study showed MjTX-II is 10–15% more toxic than the isoform MjTX-I, and this difference might be explained by the higher basicity of its C-terminal region.

Sant`Ana, CD(1,2); Monteiro, LF(1); Marcussi, S(1), (3); (1)Silveira, LB(1), Cambraia, RS(1); Sampaio, SV(2); Giglio, JR(2); Soares, AM(1,2)

Isolamento e caracterização bioquímica de proteases do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis

Os venenos de serpentes apresentam entre 90 a 95% de seu peso seco constituído de proteínas. Estas proteínas podem apresentar atividade enzimática que determina a toxicidade do veneno. Os efeitos são representados principalmente por: miotoxicidade, hemorragia, coagulação sanguínea, neurotoxicidade, edema, entre outros. Este trabalho tem por objetivo isolar e caracterizar bioquímica e farmacologicamente três proteínas do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis. As proteínas foram obtidas por dois passos cromatográficos, uma exclusão molecular em G-75 eluída em tampão AMBIC 0,05M pH 8.1 e uma afinidade em Benzamidina Sepharose eluída em Tris-HCl 0,05M pH 7.4, Tris-HCl 0,05M pH 7.4 + NaCl 0,5M e glicina 0,02M pH 3.2. Foram determinados, a massa molecular relativa e o grau de pureza das proteínas por SDS-PAGE. A atividade proteolítica das isoformas isoladas foi realizada sobre os substratos, caseína, fibrinogênio (com diferentes variantes), BAPNA, além de verificar sua atividade esterásica sobre o TAME e a atividade fosfolipásica sobre lecitina de gema de ovo. A indução de edema e hemorragia foram avaliadas em camundongos por injeções sub-plantar e intra-dérmica no dorso, respectivamente. As proteínas foram obtidas em quantidade suficiente para a realização dos ensaios e em alto grau de pureza, com a metodologia utilizada, mostrando uma Mr próxima a 26.000. A atividade proteolítica foi observada para as três proteínas, somente sobre o fibrinogênio, apresentando baixa atividade esterásica e nenhuma atividade fosfolipásica. As proteínas não induziram hemorragia na concentração de 100µg por animal, e apenas duas das isoformas induziram uma moderada atividade edematogênica em concentração de 50µg. Os resultados sugerem que se tratam de três isoformas de proteínas da classe das metaloproteases, que são abundantes em venenos de serpentes. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre mecanismos de ação, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos induzidos por estas proteínas durante o envenenamento causado por esta espécie de serpente.

(1,3)Sant`Ana, CD; 1Oliveira, DG; (1,2)Marcussi, S; (3)Ticli, FK; (3)Mazzi, MV; (3)DaSilva, JO; (4)Magalhães, MR; (1)Marins, M; (3)Sampaio, SV and (1)Soares, AM

Nucleotidic Activity on DNA induced by Crotalus snake Venom: Isolation and Biochemical Characterization of a Nucleotidase from C. durissus terrificus Venom.

Snake venoms are complex mixtures of proteins which include several enzymes displaying a large action range. Active nucleases, including phosphodiesterases, which hydrolyze DNA and/or RNA, have already been reported in venoms of snakes from several world regions. This work reported a screening of nucleotidic activity of different Crotalus species and the isolation of a nuclease from C. durissus terrificus. Venoms from C. atrox, C. durissus cunamensis, C. d. terrificus, C. d. collineatus and C. d. cascavella were assayed for nuclease activity in agarose gel plates containing 2.0mg DNA from sperm salmon, with different concentrations of venom (25-100µg). After incubation at 37°C, the plates were photographed under a UV light at different time intervals and the nucleotidic activity was expressed in cm of the resulting halos. Activity was also assayed by electrophoresis on agarose gel containing 400ng of DNA from E. coli and 1.0µg of each venom. Isolation of a nuclease from C. d. terrificus from venom was accomplished through an affinity chromatographic column, eluted with water followed by a salt concentration gradient (0 to 1M) in 0,01M Tris-HCl +0.001M EDTA, pH 7,4. The protein was assayed for purity by 12% SDS-PAGE and stained with Coomassie Brilliant Blue and Ag+. The nucleotidic activity was assayed by PAGE and radial diffusion in agarose gel. Venoms from species C. d. collineatus, C. d. cumanensis, C. d. terrificus, C. d. cascavella and C. atrox showed 0.8; 0.6; 0.8; 1.1; 0.65, respectively of nucleotidic activity. The highly purified enzyme, which was isolated in a single step, showed a single polypeptide chain and extremely active even at very low concentrations (0.5µg), snake venoms are promising sources of nucleotidic enzymes for biotechnological applications.