2004

Roberto PG, Kashima S, Marcussi S, Pereira JO, Astolfi-Filho S, Nomizo A, Giglio JR, Fontes MR, Soares AM, Franca SC.

Cloning and identification of a complete cDNA coding for a bactericidal and antitumoral acidic phospholipase A2 from Bothrops jararacussu venom.

In order to better understand the function of acidic phospholipases A2 (PLA2s) from snake venoms, expressed sequence tags (ESTs) that code for acidic PLA2s were isolated from a cDNA library prepared from the poly(A)+ RNA of venomous glands of Bothrops jararacussu. The complete nucleotide sequence (366 bp), named BOJU-III, encodes the BthA-I-PLA2 precursor, which includes a signal peptide and the mature protein with 16 and 122 amino acid residues, respectively. Multiple comparison of both the nucleotide and respective deduced amino acid sequence with EST and protein sequences from databases revealed that the full-length cDNA identified (BOJU III--AY145836) is related to an acidic PLA2 sharing similarity, within the range 55-81%, with acidic phospholipases from snake venoms. Moreover, phylogenetic analysis of amino acid sequences of acidic PLA2s from several pit viper genera showed close evolutionary relationships among acidic PLA2s from Bothrops, Crotalus, and Trimeresurus. The molecular modeling showed structural similarity with other dimeric class II PLA2s from snake venoms. The native protein BthA-I-PLA2, a nontoxic acidic PLA2 directly isolated from Bothrops jararacussu snake venom, was purified and submitted to various bioassays. BthA-I-PLA2 displayed high catalytic activity and induced Ca2+-dependent liposome disruption. Edema induced by this PLA2 was inhibited by indomethacin and dexamethasone, thus suggesting involvement of the cyclo-oxygenase pathway. BthA-I-PLA2 showed anticoagulant activity upon human plasma and inhibited phospholipid-dependent platelet aggregation induced by collagen or ADP. In addition, it displayed bactericidal activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus and antitumoral effect upon breast adrenocarcinoma as well as upon human leukemia T and Erlich ascitic tumor. Following chemical modification with p-bromophenacyl bromide, total loss of the enzymatic and pharmacological activities were observed. This is the first report on the isolation and identification of a cDNA encoding a complete acidic PLA2 from Bothrops venom, exhibiting bactericidal and antitumoral effects.

Marcussi, S(2); Fernandes, VC(1); Mazzi, MV(3); Cambraia, RS(1); Sant'Ana, CD(3); Silveira, LB(1); França, SC(1); Giglio, JR(2); Soares, AM(1)

Isolamento e caracterização bioquímica de uma Metaloprotease não-hemorrágica do veneno da serpente B. jararacussu

As metaloproteases de venenos de serpentes são responsáveis por diversos efeitos tóxicos e farmacológicos induzidos por diferentes serpentes. Estudos de mecanismo de ação dessas proteínas tem sido intensamente realizados buscando entender sua participação nos envenenamentos ofídicos. Este trabalho tem como objetivo isolar e caracterizar enzimaticamente uma nova metaloprotease do veneno de B. jararacussu, buscando o entendimento de seus mecanismos de ação. A protease de baixo peso molecular denominada BjussuMP-II foi isolada do veneno de B. jararacussu em duas etapas cromatográficas, uma troca iônica em CM-Sepharose pH 8,0, seguida por uma coluna hidrofóbica, Phenyl-Sepharose. BjussuMP-II apresentou uma única cadeia polipeptídica de PM ~ 22.000 em SDS-PAGE. Esta protease não induziu atividade hemorrágica in vivo e/ou coagulante in vitro, no entanto mostrou-se altamente proteolítica sobre o fibrinogênio e a caseína. Realizou-se uma caracterização enzimática da BjussuMP-II variando sua concentração, tempo de incubação, estabilidade em pH e temperatura, e incubação com diferentes íons. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre mecanismos de ação, e o melhor entendimento dos efeitos induzidos pelas metaloproteases de venenos de serpentes e da participação, direta ou sinérgica destas proteínas nos envenenamentos causados pela serpente Bothrops jararacussu.

Fernandes, VC(1); Marcussi, S(2); Amui, SF(3); França, SC(1); Pereira, AMS(1); Soares, AM(3)

Efeito inibitório do extrato aquoso de folhas de Scleria pterota sobre diferentes atividades tóxicas e farmacológicas de venenos de serpentes

Estudos de mecanismos de ação de proteínas de venenos estão sendo desenvolvidos, através de ensaios com diferentes extratos de plantas e inibidores naturais isolados destas. O extrato e os venenos/ou toxinas foram incubados por 30 min a 37°C em diferentes proporções e posteriormente submetidos aos diferentes ensaios enzimáticos e biológicos. O extrato mostrou-se eficiente em inibir a atividade fosfolipásica dos venenos de Bothrops jararacussu e B. alternatus, não tendo efeito sobre os venenos de B. moojeni, B. neuwiedi e Crotalus durissus terríficus, nas proporções de 1:100 e 1:200. A coagulação induzida pelos venenos foi totalmente inibida na presença do extrato em proporção de 1:10. A hemorragia induzida por B. jararacussu, B. moojeni, B. alternatus e B. neuwiedi foi inibida pelo extrato na proporção de 1:50, mostrando maior inibição para os dois primeiros venenos. A eletroforese demonstrou que o extrato não degrada as proteínas dos venenos de serpentes, sugerindo a possibilidade de interações específicas entre os inibidores vegetais e as toxinas alvo. Assim, extrato de S. pterota inibiu as atividades enzimáticas e tóxicas dos venenos de serpentes interagindo de forma diferente para cada um deles, sem alterar a integridade das proteínas que os compõe. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre mecanismos de ação destes venenos.

Vieira DF, Watanabe L, Sant'ana CD, Marcussi S, Sampaio SV, Soares AM, Arni RK

Purification and characterization of jararassin-I, A thrombin-like enzyme from Bothrops jararaca snake venom

A thrombin-like serine protease, jararassin-I, was isolated from the venom of Bothrops jararaca. The protein was obtained in high yield and purity by a single chromatographic step using the affinity resin Benzamidine-Sepharose CL-6B. SDS-PAGE and dynamic light scattering analyses indicated that the molecular mass of the enzyme was about 30 kD. The enzyme possessed fibrinogenolytic and coagulant activities. The jararassin-I degraded the Bb chain of fibrinogen while the Aa chain and g chain were unchanged. Proteases inhibitors, PMSF and benzamidine inhibited the coagulant activity. These results showed jararassin-I is a serine protease similar to coagulating thrombin-like snake venom proteases, but it specifically cleaves Bb chain of bovine fibrinogen. Single crystals of enzyme were obtained (0.2 mm x 0.2 mm x 0.2 mm) and used for X-ray diffraction experiments.

Magro AJ^a, Murakami MT^b, Marcussi S^c, Soares AM^c, Arni RK^b, Fontes MR^a

Phospholipases A₂ belong to the superfamily of proteins which hydrolyzes the sn-2 acyl groups of membrane phospholipids to release arachidonic acid and lysophospholipids. An acidic phospholipase A₂ isolated from Bothrops jararacussu snake venom presents a high catalytic, platelet aggregation inhibition and hypotensive activities. This protein was crystallized in two oligomeric states: monomeric and dimeric. The crystal structures were solved at 1.79 and 1.90 Å resolution, respectively, for the two states. It was identified a Na⁺ ion at the center of Ca²⁺-binding site of the monomeric form. A novel dimeric conformation with the active sites exposed to the solvent was observed. Conformational states of the molecule may be due to the physicochemical conditions used in the crystallization experiments. We suggest dimeric state is one found in vivo.