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CONIC 2004

Sant`Ana, CD^(1,3); Curtarelli, MB⁽¹⁾; Pereira, ALA⁽¹⁾; Ticli, FK⁽³⁾; Mazzi, MV⁽³⁾; Marcussi, S^(1,2); Magalhães, MR⁽⁴⁾; Giglio, JR⁽²⁾; Sampaio, SV⁽³⁾; Pereira, PS⁽¹⁾; Marins, MA⁽¹⁾; Soares, AM⁽³⁾

Inibição da atividade nucleotídica de venenos de serpentes por extratos de plantas

Venenos de serpentes são compostos principalmente por enzimas das classes PLA2s, proteases, LAAOs, entre outras. Essas proteínas têm sido intensamente estudadas e utilizadas como ferramentas em laboratórios para fins diagnósticos, sendo até mesmo empregadas para o entendimento de patologias e com aplicação na clínica médica. Neste trabalho foi avaliada a inibição da atividade nucleotídica de venenos de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus, por extratos aquosos de diferentes plantas (Pentacletra macroloba, Mikania glomerata, Casearia sylvestris e Mandevilla velutina). As partes das plantas utilizadas para a elaboração dos extratos foram escolhidas baseando-se em conhecimentos populares de seu uso anti-ofídico, sendo utilizados o caule de P. macroloba, as raízes de M. glomerata, folhas de C. sylvestris e xilopódio de M. velutina. As amostras de venenos e extratos foram previamente incubadas em volume final de 5µL durante 60min a 37ºC (n=3) e posteriormente avaliadas através da técnica de enzimodifusão, sendo utilizado um gel composto por agarose 2%, tampão Tris-HCl 0,05M com MgSO4 0,01M pH 7.4 acrescido de DNA de esperma de salmão como substrato e brometo de etídio para possibilitar a visualização da atividade em UV. Os extratos de P. macroloba e M. glomerata foram eficientes em inibir 100% da atividade nucleotídica induzida pelos venenos de Bothrops jararacussu (50µg), B. neuwiedi (50 e 100µg), C. d. terríficus (50 e 100µg) e C. d. collineatus (50µg), nas proporções de 1:15 e 1:30 (m/m). Os extratos de C. sylvestris e M. velutina inibiram 100% da atividade nucleotídica do veneno de B. jararacussu apenas nas primeiras 6 horas, mostrando o mesmo efeito para C. d. collineatus em 24 horas de experimento, na proporção de 1:12 (m/m). Os resultados apresentados geram dados para a identificação de novos inibidores naturais dos efeitos tóxicos do envenenamento ofídico, além de servirem como uma ferramenta na compreensão do mecanismo de ação das nucleotidases presentes em venenos de serpentes.

Marcussi, S(1,2); Sant`Ana, CD(3); Mazzi, MV(3); Silveira, LB(1); Cambraia, RS(1); Stabeli, R, G(4); Giglio, JR(2); Soares, AM(1,3)

Metaloprotease não hemorrágica isolada do veneno de Bothrops jararacussu

As metaloproteases de venenos de serpentes compreendem um grupo de enzimas que são responsáveis pelo efeito hemorrágico induzido pelas serpentes Viperidae. Este trabalho objetivou a caracterização bioquímica e farmacológica de uma metaloprotease (Bjussu-MP-II) do veneno de Bothrops jararacussu. A protease foi isolada por cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose seguida por cromatografia hidrofóbica em Phenyl Sepharose, sendo verificado seu grau de pureza e peso molecular por SDS-PAGE, e utilizada para caracterização bioquímica. A atividade enzimática foi avaliada sobre caseína, gelatina, fibrina e fibrinogênio, com variações de concentrações, pHs, temperaturas e tempo de incubação para os ensaios com fibrinogênio, sendo também testado o efeito do EDTA, da heparina e de diferentes íons sobre esta atividade. A proteína não apresentou atividade coagulante e anticoagulante, além de não mostrar-se miotóxica com dose de 100µg por via intramuscular, nem letal com dose de 300µg por via intra-peritoneal. A metaloprotease mostrou-se proteolítica, dose dependente, sobre a caseína e o fibrinogênio, permanecendo estável em diferentes pHs e temperaturas, na presença de diferentes íons e com variações no tempo de incubação, perdendo, porém a atividade fibrinogenolítica quando previamente incubada com EDTA ou heparina. A protease não induziu hemorragia em camundongos (150µg) nem se mostrou ativa sobre o BAPNA e o TAME (estando ausente a atividade esterásica). Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre mecanismos de ação, relacionando estrutura e função, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos induzidos pelas metaloproteases de venenos de serpentes e da participação, direta ou sinérgica, destas proteínas nos envenenamentos causados pela serpente Bothrops jararacussu.

Marcussi, S(1); Mazzi, MV(3); Fernandes, VC(1); Sant'Ana, CD(3); Ticli, FK(3); França, SC(1); Giglio, JR(2); Soares, AM(1)

Inibição de PLA2s isoladas de veneno de serpente Bothrops jararacussu, por substâncias naturais e artificiais.

O grande interesse médico-científico despertado pelo envolvimento destas proteínas em diferentes processos fisiopatológicos levou a uma crescente busca por ligação destas com inibidores, substratos naturais e artificiais, visando sua neutralização. Este trabalho tem por objetivo verificar o efeito inibitório de diferentes substâncias sobre as PLA_2s de B. jararacussu. Três PLA_2s (BthTX-I, Lys49; BthTX-II, Asp49; e BthA-I-PLA2s, Asp49) foram isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e testadas contra diferentes inibidores naturais e artificiais. Estudos de mecanismos de ação foram desenvolvidos através de ensaios com diferentes inibidores sintéticos (EDTA, BPB, manoalide B) e naturais (heparina, BmjMIP, manoalide A). A modificação química induzida pelo BPB resultou em inibição total das atividades, fosfolipásica e anticoagulante, induzidas pelas BthTX-II e BthA-I-PLA2. As atividades de ruptura de lipossomos e edema induzidas pelas Asp49 foram parcialmente inibidas, assim como os efeitos miotóxico, citotóxico e indução de edema causados pela BthTX-I. A interação com BPB também alterou o efeito das Asp49 sobre plaquetas, da BthA-I-PL_A2 sobre a pressão arterial e das BthTX-I e II em induzir letalidade. A incubação com EDTA resultou em inibição total da atividade fosfolipásica das Asp49, diminuindo os efeitos de ruptura de lipossomos, miotoxicidade, citotoxicidade e edematogênico da BthTX-II, e de ruptura de lipossomos da BthA-I-PL_A2. A heparina, BmjMIP e os Manoalide A e B também inibiram a citotoxicidade, a miotoxicidade, o edema e a ruptura de liposssomos, em diferentes intensidades, agindo particularmente sobre o efeito de cada proteína. As PLA₂ de venenos são algumas das substâncias naturais com atividades farmacológicas de interesse médico-científico que têm sido amplamente pesquisadas.

Marcussi, S.*; Stábeli, R.G.**; Monteiro, M.C.***; Romão, P.R.T.***; Oliveira, E.B.**; França, S.C.*; Soares, A. M.*

A L-aminoácido oxidase (LAAO) é uma enzima glicoprotéica que catalisa a deaminação oxidativa de L-aminoácidos, produzindo ?-cetoácidos, peróxido de hidrogênio e amônia. Estas enzimas encontram-se presentes nos venenos de serpentes e participam do envenenamento atuando sobre plaquetas, induzindo citotoxicidade e apoptose celular.