Serinoproteases

Sant`Ana, CD^(1,3); Curtarelli, MB⁽¹⁾; Pereira, ALA⁽¹⁾; Ticli, FK⁽³⁾; Mazzi, MV⁽³⁾; Marcussi, S^(1,2); Magalhães, MR⁽⁴⁾; Giglio, JR⁽²⁾; Sampaio, SV⁽³⁾; Pereira, PS⁽¹⁾; Marins, MA⁽¹⁾; Soares, AM⁽³⁾

Inibição da atividade nucleotídica de venenos de serpentes por extratos de plantas

Venenos de serpentes são compostos principalmente por enzimas das classes PLA2s, proteases, LAAOs, entre outras. Essas proteínas têm sido intensamente estudadas e utilizadas como ferramentas em laboratórios para fins diagnósticos, sendo até mesmo empregadas para o entendimento de patologias e com aplicação na clínica médica. Neste trabalho foi avaliada a inibição da atividade nucleotídica de venenos de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus, por extratos aquosos de diferentes plantas (Pentacletra macroloba, Mikania glomerata, Casearia sylvestris e Mandevilla velutina). As partes das plantas utilizadas para a elaboração dos extratos foram escolhidas baseando-se em conhecimentos populares de seu uso anti-ofídico, sendo utilizados o caule de P. macroloba, as raízes de M. glomerata, folhas de C. sylvestris e xilopódio de M. velutina. As amostras de venenos e extratos foram previamente incubadas em volume final de 5µL durante 60min a 37ºC (n=3) e posteriormente avaliadas através da técnica de enzimodifusão, sendo utilizado um gel composto por agarose 2%, tampão Tris-HCl 0,05M com MgSO4 0,01M pH 7.4 acrescido de DNA de esperma de salmão como substrato e brometo de etídio para possibilitar a visualização da atividade em UV. Os extratos de P. macroloba e M. glomerata foram eficientes em inibir 100% da atividade nucleotídica induzida pelos venenos de Bothrops jararacussu (50µg), B. neuwiedi (50 e 100µg), C. d. terríficus (50 e 100µg) e C. d. collineatus (50µg), nas proporções de 1:15 e 1:30 (m/m). Os extratos de C. sylvestris e M. velutina inibiram 100% da atividade nucleotídica do veneno de B. jararacussu apenas nas primeiras 6 horas, mostrando o mesmo efeito para C. d. collineatus em 24 horas de experimento, na proporção de 1:12 (m/m). Os resultados apresentados geram dados para a identificação de novos inibidores naturais dos efeitos tóxicos do envenenamento ofídico, além de servirem como uma ferramenta na compreensão do mecanismo de ação das nucleotidases presentes em venenos de serpentes.

Vieira DF, Watanabe L, Sant'ana CD, Marcussi S, Sampaio SV, Soares AM, Arni RK

Purification and characterization of jararassin-I, A thrombin-like enzyme from Bothrops jararaca snake venom

A thrombin-like serine protease, jararassin-I, was isolated from the venom of Bothrops jararaca. The protein was obtained in high yield and purity by a single chromatographic step using the affinity resin Benzamidine-Sepharose CL-6B. SDS-PAGE and dynamic light scattering analyses indicated that the molecular mass of the enzyme was about 30 kD. The enzyme possessed fibrinogenolytic and coagulant activities. The jararassin-I degraded the Bb chain of fibrinogen while the Aa chain and g chain were unchanged. Proteases inhibitors, PMSF and benzamidine inhibited the coagulant activity. These results showed jararassin-I is a serine protease similar to coagulating thrombin-like snake venom proteases, but it specifically cleaves Bb chain of bovine fibrinogen. Single crystals of enzyme were obtained (0.2 mm x 0.2 mm x 0.2 mm) and used for X-ray diffraction experiments.