Anais

Sant`Ana, CD(1,2); Monteiro, LF(1); Marcussi, S(1), (3); (1)Silveira, LB(1), Cambraia, RS(1); Sampaio, SV(2); Giglio, JR(2); Soares, AM(1,2)

Isolamento e caracterização bioquímica de proteases do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis

Os venenos de serpentes apresentam entre 90 a 95% de seu peso seco constituído de proteínas. Estas proteínas podem apresentar atividade enzimática que determina a toxicidade do veneno. Os efeitos são representados principalmente por: miotoxicidade, hemorragia, coagulação sanguínea, neurotoxicidade, edema, entre outros. Este trabalho tem por objetivo isolar e caracterizar bioquímica e farmacologicamente três proteínas do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis. As proteínas foram obtidas por dois passos cromatográficos, uma exclusão molecular em G-75 eluída em tampão AMBIC 0,05M pH 8.1 e uma afinidade em Benzamidina Sepharose eluída em Tris-HCl 0,05M pH 7.4, Tris-HCl 0,05M pH 7.4 + NaCl 0,5M e glicina 0,02M pH 3.2. Foram determinados, a massa molecular relativa e o grau de pureza das proteínas por SDS-PAGE. A atividade proteolítica das isoformas isoladas foi realizada sobre os substratos, caseína, fibrinogênio (com diferentes variantes), BAPNA, além de verificar sua atividade esterásica sobre o TAME e a atividade fosfolipásica sobre lecitina de gema de ovo. A indução de edema e hemorragia foram avaliadas em camundongos por injeções sub-plantar e intra-dérmica no dorso, respectivamente. As proteínas foram obtidas em quantidade suficiente para a realização dos ensaios e em alto grau de pureza, com a metodologia utilizada, mostrando uma Mr próxima a 26.000. A atividade proteolítica foi observada para as três proteínas, somente sobre o fibrinogênio, apresentando baixa atividade esterásica e nenhuma atividade fosfolipásica. As proteínas não induziram hemorragia na concentração de 100µg por animal, e apenas duas das isoformas induziram uma moderada atividade edematogênica em concentração de 50µg. Os resultados sugerem que se tratam de três isoformas de proteínas da classe das metaloproteases, que são abundantes em venenos de serpentes. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre mecanismos de ação, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos induzidos por estas proteínas durante o envenenamento causado por esta espécie de serpente.

(1,3)Sant`Ana, CD; 1Oliveira, DG; (1,2)Marcussi, S; (3)Ticli, FK; (3)Mazzi, MV; (3)DaSilva, JO; (4)Magalhães, MR; (1)Marins, M; (3)Sampaio, SV and (1)Soares, AM

Nucleotidic Activity on DNA induced by Crotalus snake Venom: Isolation and Biochemical Characterization of a Nucleotidase from C. durissus terrificus Venom.

Snake venoms are complex mixtures of proteins which include several enzymes displaying a large action range. Active nucleases, including phosphodiesterases, which hydrolyze DNA and/or RNA, have already been reported in venoms of snakes from several world regions. This work reported a screening of nucleotidic activity of different Crotalus species and the isolation of a nuclease from C. durissus terrificus. Venoms from C. atrox, C. durissus cunamensis, C. d. terrificus, C. d. collineatus and C. d. cascavella were assayed for nuclease activity in agarose gel plates containing 2.0mg DNA from sperm salmon, with different concentrations of venom (25-100µg). After incubation at 37°C, the plates were photographed under a UV light at different time intervals and the nucleotidic activity was expressed in cm of the resulting halos. Activity was also assayed by electrophoresis on agarose gel containing 400ng of DNA from E. coli and 1.0µg of each venom. Isolation of a nuclease from C. d. terrificus from venom was accomplished through an affinity chromatographic column, eluted with water followed by a salt concentration gradient (0 to 1M) in 0,01M Tris-HCl +0.001M EDTA, pH 7,4. The protein was assayed for purity by 12% SDS-PAGE and stained with Coomassie Brilliant Blue and Ag+. The nucleotidic activity was assayed by PAGE and radial diffusion in agarose gel. Venoms from species C. d. collineatus, C. d. cumanensis, C. d. terrificus, C. d. cascavella and C. atrox showed 0.8; 0.6; 0.8; 1.1; 0.65, respectively of nucleotidic activity. The highly purified enzyme, which was isolated in a single step, showed a single polypeptide chain and extremely active even at very low concentrations (0.5µg), snake venoms are promising sources of nucleotidic enzymes for biotechnological applications.

Marcussi, S(1); Mazzi, MV(3); Fernandes, VC(1); Sant'Ana, CD(3); Ticli, FK(3); França, SC(1); Giglio, JR(2); Soares, AM(1)

Inibição de PLA2s isoladas de veneno de serpente Bothrops jararacussu, por substâncias naturais e artificiais.

O grande interesse médico-científico despertado pelo envolvimento destas proteínas em diferentes processos fisiopatológicos levou a uma crescente busca por ligação destas com inibidores, substratos naturais e artificiais, visando sua neutralização. Este trabalho tem por objetivo verificar o efeito inibitório de diferentes substâncias sobre as PLA_2s de B. jararacussu. Três PLA_2s (BthTX-I, Lys49; BthTX-II, Asp49; e BthA-I-PLA2s, Asp49) foram isoladas do veneno de Bothrops jararacussu e testadas contra diferentes inibidores naturais e artificiais. Estudos de mecanismos de ação foram desenvolvidos através de ensaios com diferentes inibidores sintéticos (EDTA, BPB, manoalide B) e naturais (heparina, BmjMIP, manoalide A). A modificação química induzida pelo BPB resultou em inibição total das atividades, fosfolipásica e anticoagulante, induzidas pelas BthTX-II e BthA-I-PLA2. As atividades de ruptura de lipossomos e edema induzidas pelas Asp49 foram parcialmente inibidas, assim como os efeitos miotóxico, citotóxico e indução de edema causados pela BthTX-I. A interação com BPB também alterou o efeito das Asp49 sobre plaquetas, da BthA-I-PL_A2 sobre a pressão arterial e das BthTX-I e II em induzir letalidade. A incubação com EDTA resultou em inibição total da atividade fosfolipásica das Asp49, diminuindo os efeitos de ruptura de lipossomos, miotoxicidade, citotoxicidade e edematogênico da BthTX-II, e de ruptura de lipossomos da BthA-I-PL_A2. A heparina, BmjMIP e os Manoalide A e B também inibiram a citotoxicidade, a miotoxicidade, o edema e a ruptura de liposssomos, em diferentes intensidades, agindo particularmente sobre o efeito de cada proteína. As PLA₂ de venenos são algumas das substâncias naturais com atividades farmacológicas de interesse médico-científico que têm sido amplamente pesquisadas.

Silveira, LB(1); Marcussi, S(2); Ticli, FK(3); Urzeda, MA(2); Biondo, R(2); França, SC(2); Pereira, PS(2); Soares, AM(2)

Natural And Artificial Inhibitors Of Snake Venom Phospholipases A₂

Phospholipases A₂ (PLA₂) from snake venoms induce different toxic and pharmacological effects including myotoxicity, edema, hypotension, platelet aggregation inhibition, convulsion, anticoagulation and others. Natural PLA₂ inhibitors were found in different organisms as plants, marine animals, snake and opossum plasmas. Functional characterization of natural (MMV from Taberna montana extract; manoalid A, from marine animal; heparin, from human blood; BmjMIP, from B. moojeni plasma; CAB from opossum plasma) and synthetic inhibitors (manoalid B, p-bromophenacil bromide BPB, EDTA), upon the enzymatic and pharmacological activity of PLA2 from Bothrops and Crotalus snake venome. PLA₂ was assayed in gels, while the myotoxic and edema inducing were evaluated in vivo. PrTX-I and III (from B. pirajai), BthTX-I and II (from B. jararacussu), crotoxin and CB (from C. durissus terrificus), in the presence or absence of different inhibitors, following an incubation of 30 minutes at 37ºC were used. Among the natural inhibitors, the following decreasing range of activity was observed: BmjMIP > manoalid A > CAB > heparin > MMV; for the synthetic ones, the sequence was: BPB > manoalid B > EDTA. Different levels of inhibition among PLA_2s from Bothrops and Crotalus venoms were also detected. Natural inhibitors were more efficient than synthetic ones for neutralization of the toxic and enzymatic effects induced by PLA_2s. Structural and interaction studies are needed to a better understanding of inhibitory effect in order to design new models of more potent synthetic inhibitors.

MARCUSSI, S.*; TICLI, F.K.**; SILVEIRA, L.B.*; GONÇALVES, M.A.*; NETO, M.M.*; PEREIRA, P.*; FRANÇA, S.C.*; SOARES, A.M.*

Introdução

As Fosfolipases A2 (PLA2s) de venenos de serpentes induzem diferentes efeitos tóxicos e farmacológicos como miotoxicidade, neurotoxicidade, edema, letalidade, hipotensão, inibição da agregação plaquetária, convulsão, anticoagulação e outros. Inibidores naturais de PLA2s (PLIs) foram encontrados em diferentes organismos como plantas, esponjas marinhas, plasma de serpentes e de gambá.