Coagulante

CONIC 2004

Sant`Ana, CD(1,2); Monteiro, LF(1); Marcussi, S(1), (3); (1)Silveira, LB(1), Cambraia, RS(1); Sampaio, SV(2); Giglio, JR(2); Soares, AM(1,2)

Isolamento e caracterização bioquímica de proteases do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis

Os venenos de serpentes apresentam entre 90 a 95% de seu peso seco constituído de proteínas. Estas proteínas podem apresentar atividade enzimática que determina a toxicidade do veneno. Os efeitos são representados principalmente por: miotoxicidade, hemorragia, coagulação sanguínea, neurotoxicidade, edema, entre outros. Este trabalho tem por objetivo isolar e caracterizar bioquímica e farmacologicamente três proteínas do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis. As proteínas foram obtidas por dois passos cromatográficos, uma exclusão molecular em G-75 eluída em tampão AMBIC 0,05M pH 8.1 e uma afinidade em Benzamidina Sepharose eluída em Tris-HCl 0,05M pH 7.4, Tris-HCl 0,05M pH 7.4 + NaCl 0,5M e glicina 0,02M pH 3.2. Foram determinados, a massa molecular relativa e o grau de pureza das proteínas por SDS-PAGE. A atividade proteolítica das isoformas isoladas foi realizada sobre os substratos, caseína, fibrinogênio (com diferentes variantes), BAPNA, além de verificar sua atividade esterásica sobre o TAME e a atividade fosfolipásica sobre lecitina de gema de ovo. A indução de edema e hemorragia foram avaliadas em camundongos por injeções sub-plantar e intra-dérmica no dorso, respectivamente. As proteínas foram obtidas em quantidade suficiente para a realização dos ensaios e em alto grau de pureza, com a metodologia utilizada, mostrando uma Mr próxima a 26.000. A atividade proteolítica foi observada para as três proteínas, somente sobre o fibrinogênio, apresentando baixa atividade esterásica e nenhuma atividade fosfolipásica. As proteínas não induziram hemorragia na concentração de 100µg por animal, e apenas duas das isoformas induziram uma moderada atividade edematogênica em concentração de 50µg. Os resultados sugerem que se tratam de três isoformas de proteínas da classe das metaloproteases, que são abundantes em venenos de serpentes. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre mecanismos de ação, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos induzidos por estas proteínas durante o envenenamento causado por esta espécie de serpente.

Marcussi, S(2); Fernandes, VC(1); Mazzi, MV(3); Cambraia, RS(1); Sant'Ana, CD(3); Silveira, LB(1); França, SC(1); Giglio, JR(2); Soares, AM(1)

Isolamento e caracterização bioquímica de uma Metaloprotease não-hemorrágica do veneno da serpente B. jararacussu

As metaloproteases de venenos de serpentes são responsáveis por diversos efeitos tóxicos e farmacológicos induzidos por diferentes serpentes. Estudos de mecanismo de ação dessas proteínas tem sido intensamente realizados buscando entender sua participação nos envenenamentos ofídicos. Este trabalho tem como objetivo isolar e caracterizar enzimaticamente uma nova metaloprotease do veneno de B. jararacussu, buscando o entendimento de seus mecanismos de ação. A protease de baixo peso molecular denominada BjussuMP-II foi isolada do veneno de B. jararacussu em duas etapas cromatográficas, uma troca iônica em CM-Sepharose pH 8,0, seguida por uma coluna hidrofóbica, Phenyl-Sepharose. BjussuMP-II apresentou uma única cadeia polipeptídica de PM ~ 22.000 em SDS-PAGE. Esta protease não induziu atividade hemorrágica in vivo e/ou coagulante in vitro, no entanto mostrou-se altamente proteolítica sobre o fibrinogênio e a caseína. Realizou-se uma caracterização enzimática da BjussuMP-II variando sua concentração, tempo de incubação, estabilidade em pH e temperatura, e incubação com diferentes íons. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre mecanismos de ação, e o melhor entendimento dos efeitos induzidos pelas metaloproteases de venenos de serpentes e da participação, direta ou sinérgica destas proteínas nos envenenamentos causados pela serpente Bothrops jararacussu.

Silveira, LB(1); Marcussi, S(2); Ticli, FK(3); Urzeda, MA(2); Biondo, R(2); França, SC(2); Pereira, PS(2); Soares, AM(2)

Natural And Artificial Inhibitors Of Snake Venom Phospholipases A₂

Phospholipases A₂ (PLA₂) from snake venoms induce different toxic and pharmacological effects including myotoxicity, edema, hypotension, platelet aggregation inhibition, convulsion, anticoagulation and others. Natural PLA₂ inhibitors were found in different organisms as plants, marine animals, snake and opossum plasmas. Functional characterization of natural (MMV from Taberna montana extract; manoalid A, from marine animal; heparin, from human blood; BmjMIP, from B. moojeni plasma; CAB from opossum plasma) and synthetic inhibitors (manoalid B, p-bromophenacil bromide BPB, EDTA), upon the enzymatic and pharmacological activity of PLA2 from Bothrops and Crotalus snake venome. PLA₂ was assayed in gels, while the myotoxic and edema inducing were evaluated in vivo. PrTX-I and III (from B. pirajai), BthTX-I and II (from B. jararacussu), crotoxin and CB (from C. durissus terrificus), in the presence or absence of different inhibitors, following an incubation of 30 minutes at 37ºC were used. Among the natural inhibitors, the following decreasing range of activity was observed: BmjMIP > manoalid A > CAB > heparin > MMV; for the synthetic ones, the sequence was: BPB > manoalid B > EDTA. Different levels of inhibition among PLA_2s from Bothrops and Crotalus venoms were also detected. Natural inhibitors were more efficient than synthetic ones for neutralization of the toxic and enzymatic effects induced by PLA_2s. Structural and interaction studies are needed to a better understanding of inhibitory effect in order to design new models of more potent synthetic inhibitors.

MONTEIRO, L.F.; SILVA, L.A.; COPPEDE, J.; GONÇALVES, C.A.G.; SANTOS, F.; SANTANA, E.I.F.; NASCIMENTO, M.M.; MATRANGULO, P.V.F.; BOM, C.A.M.; ARROYO, A.G.; OLIVEIRA, A.H.; FEITOZA, J.A.; PIRES, M.A.; PIZZO, V.; MARCUSSI, S.; SOARES, A.M.

Os venenos animais são ricos numa variedade de peptídeos, proteínas e enzimas com diferentes efeitos tóxicos e farmacológicos de interesse na clínica médica-científica. Proteínas enzimáticas como serino-proteases, metaloproteases e fosfolipases A2 são responsáveis pela indução das atividades coagulante, hemorrágica e miotóxica, respectivamente, induzida pelos venenos de serpentes do gênero Bothrops. Enquanto que no veneno de cascavel Crotalus d. terrificus apresenta proteínas altamente neurotóxicas. Este trabalho propõe novas estratégias cromatográficas para o isolamento de fosfolipases A2 miotóxicas e neurotóxicas, além de enzimas coagulantes como as serino-proteases. Para o isolamento das serino-proteases foi utilizado cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose, enquanto que para o isolamento das PLA2s foram utilizadas cromatografia de afinidade Anti-PLA2s-Sepharose e resina de hidrofobicidade em Fenil-Sepharose. O grau de pureza foi avaliado em eletroforese desnaturante (SDS-PAGE) coradas por azul coomassie e pela coloração de prata. Os métodos utilizando cromatografia de afinidade mostraram-se eficientes para o isolamento das proteínas em alto grau de pureza (80-90%) a partir do veneno total, enquanto que a resina de hidrofobicidade foi utilizada como segunda etapa na purificação completa destas proteínas. A SDS-PAGE confirmou o grau de pureza destas amostras, sendo que as PLA2s apresentaram uma massa molecular de ~13.500 e as serino-protease ~30.000, respectivamente. Estas novas metodologias se mostraram eficientes para o isolamento de algumas proteínas dos venenos de serpentes em alto grau de pureza. Estes resultados foram executados durante a disciplina Métodos de Purificação de Biomoléculas pelos alunos do curso Seqüencial em Bio-Tecnologias, corroborando para a idéia de utilização de modelos científicos em cursos didáticos correlacionados à pesquisa. Os ensaios enzimáticos e biológicos serão realizados no decorrer da próxima disciplina, permitindo desta forma um aprendizado seqüencial e mais completo do tema abordado.