Miotóxica

Sant`Ana, CD(1,2); Monteiro, LF(1); Marcussi, S(1), (3); (1)Silveira, LB(1), Cambraia, RS(1); Sampaio, SV(2); Giglio, JR(2); Soares, AM(1,2)

Isolamento e caracterização bioquímica de proteases do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis

Os venenos de serpentes apresentam entre 90 a 95% de seu peso seco constituído de proteínas. Estas proteínas podem apresentar atividade enzimática que determina a toxicidade do veneno. Os efeitos são representados principalmente por: miotoxicidade, hemorragia, coagulação sanguínea, neurotoxicidade, edema, entre outros. Este trabalho tem por objetivo isolar e caracterizar bioquímica e farmacologicamente três proteínas do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis. As proteínas foram obtidas por dois passos cromatográficos, uma exclusão molecular em G-75 eluída em tampão AMBIC 0,05M pH 8.1 e uma afinidade em Benzamidina Sepharose eluída em Tris-HCl 0,05M pH 7.4, Tris-HCl 0,05M pH 7.4 + NaCl 0,5M e glicina 0,02M pH 3.2. Foram determinados, a massa molecular relativa e o grau de pureza das proteínas por SDS-PAGE. A atividade proteolítica das isoformas isoladas foi realizada sobre os substratos, caseína, fibrinogênio (com diferentes variantes), BAPNA, além de verificar sua atividade esterásica sobre o TAME e a atividade fosfolipásica sobre lecitina de gema de ovo. A indução de edema e hemorragia foram avaliadas em camundongos por injeções sub-plantar e intra-dérmica no dorso, respectivamente. As proteínas foram obtidas em quantidade suficiente para a realização dos ensaios e em alto grau de pureza, com a metodologia utilizada, mostrando uma Mr próxima a 26.000. A atividade proteolítica foi observada para as três proteínas, somente sobre o fibrinogênio, apresentando baixa atividade esterásica e nenhuma atividade fosfolipásica. As proteínas não induziram hemorragia na concentração de 100µg por animal, e apenas duas das isoformas induziram uma moderada atividade edematogênica em concentração de 50µg. Os resultados sugerem que se tratam de três isoformas de proteínas da classe das metaloproteases, que são abundantes em venenos de serpentes. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre mecanismos de ação, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos induzidos por estas proteínas durante o envenenamento causado por esta espécie de serpente.

Silveira, LB(1); Marcussi, S(2); Ticli, FK(3); Urzeda, MA(2); Biondo, R(2); França, SC(2); Pereira, PS(2); Soares, AM(2)

Natural And Artificial Inhibitors Of Snake Venom Phospholipases A₂

Phospholipases A₂ (PLA₂) from snake venoms induce different toxic and pharmacological effects including myotoxicity, edema, hypotension, platelet aggregation inhibition, convulsion, anticoagulation and others. Natural PLA₂ inhibitors were found in different organisms as plants, marine animals, snake and opossum plasmas. Functional characterization of natural (MMV from Taberna montana extract; manoalid A, from marine animal; heparin, from human blood; BmjMIP, from B. moojeni plasma; CAB from opossum plasma) and synthetic inhibitors (manoalid B, p-bromophenacil bromide BPB, EDTA), upon the enzymatic and pharmacological activity of PLA2 from Bothrops and Crotalus snake venome. PLA₂ was assayed in gels, while the myotoxic and edema inducing were evaluated in vivo. PrTX-I and III (from B. pirajai), BthTX-I and II (from B. jararacussu), crotoxin and CB (from C. durissus terrificus), in the presence or absence of different inhibitors, following an incubation of 30 minutes at 37ºC were used. Among the natural inhibitors, the following decreasing range of activity was observed: BmjMIP > manoalid A > CAB > heparin > MMV; for the synthetic ones, the sequence was: BPB > manoalid B > EDTA. Different levels of inhibition among PLA_2s from Bothrops and Crotalus venoms were also detected. Natural inhibitors were more efficient than synthetic ones for neutralization of the toxic and enzymatic effects induced by PLA_2s. Structural and interaction studies are needed to a better understanding of inhibitory effect in order to design new models of more potent synthetic inhibitors.

Sant`Ana, C. D. 1,2; Monteiro, L. F. 1; Marcussi, S. 1,3; 1Silveira, L. B. 1, Cambraia, R. S. 1; Sampaio, S. V. 2; Giglio, J. R.2; Soares, A. M. 1,2
E-mail: smarcussi@rbi.fmrp.usp.br

Os venenos de serpentes apresentam entre 90 a 95% de seu peso seco constituído de proteínas. Estas proteínas podem apresentar atividade enzimática que determina a toxicidade do veneno. Os efeitos são representados principalmente por: miotoxicidade, hemorragia, coagulação sanguínea, neurotoxicidade, edema, entre outros. Este trabalho tem por objetivo isolar e caracterizar bioquímica e farmacologicamente três proteínas do veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis. As proteínas foram obtidas por dois passos cromatográficos, uma exclusão molecular em G-75 eluída em tampão AMBIC 0,05M pH 8.1 e uma afinidade em Benzamidina Sepharose eluída em Tris-HCl 0,05M pH 7.4, Tris-HCl 0,05M pH 7.4 + NaCl 0,5M e glicina 0,02M pH 3.2. Foram determinados, a massa molecular relativa e o grau de pureza das proteínas por SDS-PAGE. A atividade proteolítica das isoformas isoladas foi realizada sobre os substratos, caseína, fibrinogênio (com diferentes variantes), BAPNA, além de verificar sua atividade esterásica sobre o TAME e a atividade fosfolipásica sobre lecitina de gema de ovo. A indução de edema e hemorragia foram avaliadas em camundongos por injeções sub-plantar e intra-dérmica no dorso, respectivamente.

Zuliani JP, Gutierrez JM, Casais e Silva LL, Coccuzzo Sampaio S, Lomonte B, Pereira Teixeira Cde F

The in vitro effects of myotoxin III (MT-III), an Asp-49 catalytically-active phospholipase A2, and myotoxin II (MT-II), a catalytically-inactive Lys-49 variant, isolated from Bothrops asper snake venom, on phagocytosis and production of hydrogen peroxide (H2O2) by thioglycollate-elicited macrophages were investigated. MT-II and MT-III were cytotoxic to mouse peritoneal macrophages at concentrations higher than 25 μg/ml. At non-cytotoxic concentrations, MT-II stimulated Fcγ, complement, mannose and β-glucan receptors-mediated phagocytosis, whereas MT-III stimulated only the mannose and β-glucan receptors-mediated phagocytosis. Moreover, both myotoxins induced the release of H2O2 by thioglycollate-elicited macrophages, MT-III being the most potent stimulator. MT-II induced the release of H2O2 only at a concentration of 3.2 μg/ml (130% increment) while MT-III induced this effect at all concentrations tested (0.5–2.5 μg/ml; average of 206% increment). It is concluded that, at non-cytotoxic concentrations, MT-II and MT-III activate defense mechanisms in macrophages upregulating phagocytosis, mainly via mannose and β-glucan receptors, and the respiratory burst.

XII Congresso de Iniciação Científica da Universidade Federal de São Carlos - UFSCar