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Procedimento de purificação

O veneno de Bothrops moojeni foi obtido do Serpentário Bioagents (Batatais-SP) e fracionado em coluna de CM-Sepharose, previamente eluído em tampão bicarbonato de amônio (NH4HCO3) pH 8.0 a 0.05M e centrifugado a 480 x g por 10 min em temperatura ambiente. Uma alíquota desta solução foi usada para aferir a absorbância total em 280nm (A280nm) e estimar o conteúdo protéico através do método do microbiureto (Itzhaki e Gill, 1964). Após aplicar a amostra à coluna de CM-Sepharose (2.0 x 20cm), iniciou-se a eluição com baixa concentração de tampão seguido de um gradiente de 0.05 a 0.5M a pH 8.0 a temperatura ambiente. Frações de 3 ml/tubo, foram coletadas em um coletor de frações LKB num fluxo de 20ml/h. A absorbância das frações coletadas foram aferidas em 280nm, em espectrofotômetro Beckman DU-640 (Soares et al., 1998). O grau de pureza da fosfolipase A2, denominada de MjTX-II, foi avaliado em SDS-PAGE (12%), PAGE básica a 10%, focalização isoelétrica, sequenciamento de aminoácidos N-terminal, RP-HPLC e espectrometria de massa (Soares et al., 2000a;b; 2003). O peso molecular da MjTX-II também foi determinado por SDS-PAGE e espectrometria de massa de MALDI-TOF. A estrutura secundária da MjTX-II nativa e modificada quimicamente foi avaliada por dicroísmo circular (190-250nm) em equipamento JASCO 810 (Tokyo, Japão).

Atividade miotóxica

Grupos de 05 camundongos (18-22g) foram injetados no músculo gastrocnemius direito com 50 µL de amostra contendo diferentes concentrações de MjTX-II dissolvidas em solução salina tamponada em fosfato (PBS). Após 1, 3, 6 horas o sangue foi coletado da cauda dos animais com auxílio de tubos capilares heparinizados e posteriormente centrifugados a 4000 xg para a separação do plasma. A atividade de creatina-cinase (CK) foi determinada usando 4 µL do plasma e, posteriormente incubado por 3 min a 37°C com 1,0 ml do reagente, de acordo com o protocolo cinético CK-UV (Sigma  Chemical Co). A atividade foi expressa em U/L, onde uma unidade corresponde à produção de 1 µmoL de NADH/minuto (Soares et al., 2000a;b; 2001a;b).

Atividade de indução de edema

Grupos de 05 camundongos (18-22g) foram injetados na região sub-plantar da pata direita com 50 µL de amostra contendo diferentes doses de MjTX-II, dissolvidas em solução salina tamponada em fosfato (PBS). Após 0,5 h, o edema de pata foi determinado com auxílio de um paquímetro de baixa pressão (Mytutoyo, Japão) (Soares et al., 2000a;b; 2001a;b). Os valores obtidos no tempo zero foram então subtraídos e as diferenças expressas em unidades de edema induzido em milímetros (média ± SD).

Rompimento de Lipossomos

Lipossomos carregados negativamente (fosfatidilcolina 63 µM; diacetilfosfato 18 µM e colesterol 9 µM) foram obtidos da Sigma  Chemical Co. O ensaio foi realizado, em microplacas, incubando 20 µL da suspensão de lipossomos e 20 µl de MjTX-II (em PBS) por 30 min a 37° ou 4°C (Soares et al. 2000a;b; 2001a;b).

Atividade citotóxica em linhagens tumorais

Atividade citotóxica de PLA2s em linhagens tumorais foi analisada com 3-(4,5-Dimetil tiazol 2-il) 2,5-Difenil Brometo de Tetrazolium (MTT) conforme descrito por Mosmann (1983). Células tumorais cultivadas em frascos apropriados e mantidas em crescimento exponencial foram removidas dos frascos de cultura celular pela adição de 1ml de Tripsina 0,5%, EDTA 0,02% em tampão PBS no meio RPMI contínuo eram destacado com tripsina 0,05%, EDTA 0,02% em tampão PBS e lavou 3 vezes com médio de RPMI às 500xg/15min/10(C. Celas estavam bem dispostas em microplacas a uma densidade de 1×105 células por poço. Depois das 24h, o médio vem médio afastado e fresco, com ou sem concentrações diferentes de combinações indicadas (PLA2 ou metotrexato, 1–0.01mg/ml), foi adicionado aos poços e incubado por 24h (Roberto al et., 2004). Em alguns ensaios, atividade citotóxica foi determinada em células de tumor ascítico de Erlich (EAT) crescidas na cavidade de peritoneal de ratos suíços (Chwetzoff et al., 1989a). EAT foram suspensas em tampão Tyrode-Ringer (4x106 células no volume final de 1ml) e incubadas com várias concentrações de PLA2 (2-0.01mg/ml) por 60min. Cem microlitros de solução Azul de triphan (1% em salina) foi adicionado e as células inviáveis foram contadas em um hemocitometro.

Atividades Biológicas Induzidas pela MjTX-II isolada do veneno de Bothrops mojeni.

(A): Atividade Miotóxica de B. moojeni MjTX-II (20-120µg) em ratos. A Creatina cinase (CK) no plasma aumentou depois de injetar a toxina via intramuscular.

(B): O efeito citotóxico de MjTX-II (5-50µg) em células do mioblastos/miotubos C2C12 foi estimado pela liberação da Lactato Desidrogenase (LDH) no sobrenadante, 3 h após a exposição das células às amostras.

(C): Na atividade neurotóxica de B. moojeni MjTX-II (25µg) em preparações neuro-musculares de camundongos, os resultados são apresentados como média  SD (n=4).

(D): Indução de edema tempo-dependente de 50µg de MjTX-II após injeção na pata de camundongos machos Swiss de 18-22 g.

(E): Peroxidase liberada de lipossomos incubados a 4° ou 37°C por 30 min com MjTX-II. A liberação é expressa como porcentagem. 100% foi considerado a liberação da peroxidase dos lipossomos incubados com 0.2% Triton X-100. O PBS foi incluído como um controle negativo em todas as experiências.

Os resultados são apresentados com média  SD (n=6).

A MjTX-II induz a mionecrose na fibra muscular, evidenciado pela microscopia de luz intravital (resultados não apresentados), e liberação de CK dose dependente; esta miotoxina é citotóxica sobre células musculares, induz bloqueio da junção neuro-muscular e formação de edema tempo-dependente. MjTX-II também rompe lipossomos carregados negativamente de maneira dose-temperatura dependente. Esta proteína apresenta toxicidade via i.p. (DL50 ~8 mg/kg), e não apresenta atividade anticoagulante ou atividade PLA2 em gema de ovo.

Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2006 Mar-Apr;142(3-4):371-81. Epub 2006 Jan 24

Link do Artigo Científico publicado na Web