Adicionar comentário

Introdução e justificativa

Proteínas de venenos de serpentes têm sido utilizadas como ferramentas em laboratórios, como modelos na elaboração de novos fármacos e até mesmo diretamente na clínica médica. As PLA2s desempenham papéis importantes no catabolismo de lipídios da dieta e no metabolismo geral de lipídios estruturais de membranas celulares, estando envolvidas em uma grande variedade de doenças inflamatórias humanas, nos envenenamentos ofídicos e por abelhas, sendo de grande interesse médico-científico. O estudo destas proteínas podem responder questões sobre os mecanismos de ação durante o envenenamento ou resultar na cura para algumas doenças.

Metodologia

O veneno de B. neuwiedi pauloensis foi aplicado em uma coluna de CM-Sepharose previamente equilibrada com tampão bicarbonato de amônio 50mM, pH 5.5. A fração com a PLA2 ativa foi recromatografada em gel de filtração Sephadex G-50, equilibrada e eluída em mesmo tampão, pH 8.0. A fração ativa foi submetida a uma RP-HPLC coluna C18. As PLA2s miotóxicas foram nomeados BnpTx-I e II. Foi realizado um PAGE para proteínas ácidas e SDS-PAGE, seguindo metodologias previamente descritas (Laemmli,1970). A focalização isoelétrica foi feita de acordo com Vesterberg (1972). A determinação da composição em animoácidos foi realizada conforme descrito por Spackman et al. (1 958). Para quantificação das proteínas foi usado o método micro-biureto de Itzhaki e Gill (1964). Para obtenção da seqüência N-terminal as PLA2s foram dissolvidas em tampão Tris-HCl 250mM, pH 8.2 contendo EDTA 0,1% (w/v). Após ter sido excitada com N2 a solução foi incubada por 4h a 50°C no escuro. A amostra reduzida foi então purificado em RP-HPLC coluna C18 e a seqüência N-terminal foi determinada por metodologia previamente descrita (Rodrigues et al, 2000).

As seqüências N-terminais das BnpTX-I e II foram alinhadas com seqüências disponíveis no Gene Bank e Swiss-Prot usando o programa CLUSTAL (Thompson et al, 1994). A Atividade fosfolipásica foi analisada utilizando o método de titulação potenciométrica descrito por de Haas et al. (1968). O tempo de recalcificação do plasma bovino citratado foi utilizado para determinação da atividade anticoagulante (Álvaro e Gutiérrez, 1988). A indução de edema foi realizada com injeção das PLA2s (25µg/µl) por via sub-plantar. As patas foram medidas com paquímetro de baixa pressão 30, 60 e 180min após a injeção (Soares et al., 2000a). A atividade miotóxica foi avaliada por dosagem da atividade da enzima creatina cinase, usando o kit CK-UV, após injeção das PLA2s (25-50µg/µl) no gastrocnêmius direito de camundongos. A atividade foi expressa em U/l, resultante da fosforilação de um µmol de creatina/mim a 25°C. A análise histológica das mionecroses foram feitas com pequenas secções dos músculos, examinandas em microscópio de luz (Soares et al., 1998a).

A capacidade das PLA2s de induzir atividade bactericida contra E.coli (ATCC 29648) e S. aureus (ATCC 25923) foi comprovada, conforme descrito por Páramo et. al.(1998). O nervo frênico do músculo diafragmático obtido de camundongos, foi colocado em banho de órgão contendo solução Tyrode’s a 37°C e ligado por um fio F50 a um transformador para registrar as tensões musculares. Em alguns experimentos, Mn2+ (0.1mM) foi adicionado à solução Tyrode’s. A modificação de His48 com (BPB) foi realizada  conforme descrito previamente (Díaz -Oreiro e Gutiérrez, 1997). A inibição pelo EDTA (1mM), pela heparina (5mM) (Fragmin, Mr~15,000) ou Mn2+ (1mM) foi avaliada após incubação por 30mim a 37°C. Anticorpos de coelho purificados para proteínas de B.jararacussu (BthTX-I e BthTX-II), B. moojeni (MjTX-II), B. asper (Basp-II) e anti- peptídeo C-terminal (115-129) de Basp-II, foram adicionados em poços, em  triplicata, diluídos em solução (A) contendo BSA 2% (w/v) e incubados. Após lavagens, os anticorpos ligados foram detectados com imunoglobulina conjugada de anti-coelho para fosfatase alcalina e incubados por 90min. O colorido foi removido com p-nitrofenilfosfato e as absorbâncias foram analisadas em leitor de microplaca a 410nm (Angulo et al., 2001). Os anticorpos purificados foram testados para as PLA2s.